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Asian J. 2011, 6, 1800）。   図2 天然の生物発光基質（セレンテラジン）のC-6位の蛍光色素修飾の模式図   図3 蛍光色素付き発光基質の概念（左）とその例（右）   また、新たに合成した発光基質に対して最適に発光する新たな人工生物発光酵素（ALuc®）群も開発した。産総研では、開発したALuc®の名前に固有の番号を付けてきたので、今回も新たなALuc®類にALuc17、ALuc18などの名前を付与した。これらは、既存のALuc®のアミノ酸配列を参考にしつつ、発光プランクトン由来の発光酵素のデータベースから頻度の高いアミノ酸を抽出し、各配列間のアミノ酸相同性を高める方向で配列を改変して作製した。   図4　今回合成した蛍光色素付き発光基質の化学構造 黄色影は、導入した官能基を表す。   今回の開発は、蛍光色素付き発光基質が発光酵素と反応してエネルギーを産生し、そのエネルギーは蛍光色素に伝わって蛍光色素がない場合とは異なる色の蛍光を発光するという作業仮説に基づいて行った。実際に、今回開発した蛍光色素付き発光基質を酸化させることにより化学発光を誘発したところ、青から赤まで多様な化学発光色を示した（図5（A））。これらは、化学発光共鳴エネルギー移動（CRET）によって発光基質が産生した共鳴エネルギーが、蛍光色素に移動して、多様な色の光を発光したと考えられる。これらの蛍光色素付き発光基質を今回開発した人工生物発光酵素のひとつであるALuc16と混ぜると、生物発光エネルギー移動（BRET）による発光とみられるスペクトルが観察できた（図5（B））。一方、蛍光色素付き発光基質の合成過程の中間体であるアジド基付き発光物質6-N3-CTZを生物発光酵素RLuc8.6-535と混ぜると、発光は青色（400 nm付近）になるが、このアジド基に蛍光色素をつけた発光基質6-FITC-CTZと混ぜると緑色の発光（522 nm付近）を示した（図5（D））。別の生物発酵酵素RLuc8を用いても同様の発色現象がみられた（図5（C））。 このように、発光基質に蛍光色素などを導入することによって、さまざまな発光色が得られた。導入する蛍光色素を変えることにより、さらに多彩な発光色の創出が期待される。 図5 (A) 蛍光色素付き発光基質の化学発光共鳴エネルギー移動（CRET）による発光スペクトル （B）人工生物発光酵素（ALuc16）共存下での蛍光色素付き発光基質の生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）による発光スペクトル （C）ウミシイタケ生物発光酵素（RLuc8）共存下での蛍光色素付き発光基質のBRETによる発光スペクトル （D）ウミシイタケ生物発光酵素（RLuc8.6-535）共存下での蛍光色素付き発光基質のBRETによる発光スペクトル   今回の蛍光色素付き発光基質の合成中間体であるアジド基を付けた発光基質（6-N3-CTZ、2-N3-CTZ）についても、ALuc®群と混合して、その発光輝度と発光色を調べた（図6）。その結果、アジド基を導入していない天然の発光基質（nCTZ）に比べて、かなり強い発光輝度を示し（図6（A））、発光色も変化していた（図6（B））。強い発光が求められる用途への応用が考えられる。 特定の発光基質と発光酵素の組み合わせの場合だけ、特異的に発光する現象もみられた。例えば、生きた動物細胞のイメージングでも、同様に特異的な発光現象が確認できた。従って2つ以上の特異的な発光基質と発光酵素の組み合わせを共存させた状態でバイオアッセイ（マルチプレックスアッセイ）を行うことも考えられる。 今回、蛍光と生物発光が持つ限界を克服するための新たなアプローチとして、天然の生物発光基質に蛍光色素を導入した独自の発光システムが作製でき、従来になかった発光特性（多彩な発光色、酵素選択的な発光、高い発光輝度など）が実現できたといえる。 図6 (A) 新規人工発光基質と発光酵素の組み合わせによる相対的な発光輝度の比較 （RLU: 相対的発光ユニット） （B）ALuc16共存下での各発光基質の発光スペクトル   動画1：人工生物発光酵素（ALuc16）に新たな発光基質（6-N3-CTZ）を添加したことによる生物発光現象   今後の予定 今回の成果をベースに、更なる高輝度・高安定性・近赤外線発光特性を示す生物発光基質の開発に取り組む。また、今回開発した発光システムを実際の生体イメージングやバイオアッセイに応用する研究を並行して進め、革新的な分子イメージングモデルの創製を目指す。 用語の説明 ◆蛍光色素 光を吸収し基底状態に戻る際に蛍光を放つ化学物質を指す。今まで多くの天然蛍光色素や合成蛍光色素が開発されている。フルオレセインやCy5色素などが有名である。[参照元へ戻る] ◆生物発光 ホタル（節足動物）、ウミシイタケ（刺胞動物）などの生体内の生物発光酵素（光を放つ化学反応を触媒する生物由来の酵素）が、生物発光基質（小分子化学物質）と特異的な触媒反応をし、基質が貯めている化学エネルギーを発散して電子を励起させ、基底状態に戻る時に光を放つ現象である。熱を伴わない光（冷光）を指す。化学エネルギーを用いる点で化学発光の一種である。[参照元へ戻る] ◆生物発光基質 発光酵素と特異的な触媒反応をし、光を放つ小分子化学物質。化学エネルギーを貯めている化学物質であり、発光酵素と結合するなど一定条件が満たされれば、その化学エネルギーで電子を励起し、基底状態に戻る時に光が出る。[参照元へ戻る] ◆人工生物発光酵素（ALuc®） プランクトン由来の発光酵素データベースから頻度の高いアミノ酸を抽出して人工的に作りあげた一連の生物発光酵素をいう。産総研が初めて開発した技術である。一般的に従来の発光酵素より発光輝度と安定性が優れている。[参照元へ戻る] ◆化学発光/生物発光共鳴エネルギー移動現象（CRET/BRET） 発光の共鳴エネルギーは、周囲の蛍光物質に移ることがある。この際の蛍光は、本来の共鳴エネルギーの波長より長波長側へシフトすることが一般的である。BRETは生物発光酵素の酵素活性により発光が発生し、その発光共鳴エネルギーが近隣の蛍光色素などに移る場合を指す。[参照元へ戻る] ◆アジド基 化学構造が3つの窒素（N）が繋がった構造を持つ官能基（N3）を指す。アジド基を持つ化学物質をアジ化物という。[参照元へ戻る] ◆バイオアッセイ 生物が持つ固有の機能を活用した測定（アッセイ）系をいう。細胞系と非細胞系のバイオアッセイがある。非細胞系の代表的なバイオアッセイは、抗原・抗体反応を用いた診断試薬である。妊娠診断試薬や排卵診断試薬などが有名である。細胞系バイオアッセイの代表的なものはレポータージーンアッセイである。刺激依存的に、レポータータンパク質が発現される仕組みである。レポータータンパク質による輝度・発色度などは、刺激の強度・持続度と比例する。[参照元へ戻る] お問い合わせお問い合わせフォーム 産総研について アクセス 調達情報 研究成果検索 採用情報 報道・マスコミの方へ メディアライブラリー お問い合わせ English ニュース お知らせ一覧 研究成果一覧 イベント一覧 受賞一覧 研究者の方へ はじめての方へ 研究成果検索 研究情報データベース お問い合わせ 採用情報 ビジネスの方へ はじめての方へ 研究成果検索 事例紹介 協業・提携のご案内 お問い合わせ AIST Solutions 一般の方へ はじめての方へ イベント情報 スペシャルコンテンツ 採用情報 お問い合わせ 記事検索 産総研マガジンとは 公式SNS @AIST_JP 産総研チャンネル 公式SNS @AIST_JP 産総研 チャンネル サイトマップ このサイトについて プライバシーポリシー 個人情報保護の推進 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Copyright © National Institute of Advanced Industrial Science and Technology （AIST） （Japan Corporate Number 7010005005425）. 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