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(a) 今回明らかとなったCXCR1-CXCL8の複合体の全体構造（左：マップ、右：リボンモデル）。(b) CXCL8の結合様式 (c) CXCL8を用いた活性機構。野生型（WT）や単量体変異体（Trapped monomer）と比較して、二量体変異体（Trapped dimer）では活性が低い。 ●単量体・二量体状態のCXCL8の調製 CXCL8は生体内で単量体と二量体の平衡状態で存在しています。これまでの研究で、受容体であるCXCR1は単量体を優位に結合し、CXCR2では双方に結合することが示唆されてきました。CXCR1におけるCXCL8の結合性を明らかにするために、大腸菌発現系を用いて単量体・二量体の双方となりうる野生型CXCL8（Wild type）を調製しました。さらにアミノ酸変異導入により単量体（Trapped monomer）または二量体（Trapped dimer）のみをとるCXCL8変異体を精製しました。これら調製サンプルの状態をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）＊８と横浜市大・明石知子教授によるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）＊９により確認をしました（図2）。以上から、3種類のCXCL8の調製に成功し、これらを利用して構造解析・活性測定を行いました。   図2. CXCL8の精製結果とESI-MSによる質量分析 (a) SECによる各タンパク質の精製結果。高分子量側でWild typeとTrapped dimerのピーク（赤、黒）が観測され、Trapped monomerが低分子量側で確認された（青）。(b-d) ESI-MSによる観測結果。各サンプルの状態は理論値と実測値で概ね一致していた。 ●CXCR1とCXCL8複合体の構造とリガンドの選択性 クライオ電子顕微鏡単粒子解析により全体構造が3.4 Åを決定しました。CXCR1はN末端のループ領域と細胞外側のポケットの2箇所でCXCL8を認識しており、特に細胞外側に突き刺さるように存在するCXCL8のN末端は塩橋を形成していました（図3a-c）。結合に関与すると考えられるアミノ酸残基について変異体を作製し、東北大学・井上飛鳥教授によるNanoBiT Gタンパク質乖離アッセイ＊10の結果から、それらのアミノ酸残基が相互作用していることを明らかとしました（図3d）。   図3. (a-c) CXCR1のCXCL8認識機構 (d) 変異体を用いたNanoBiT Gタンパク質乖離アッセイの結果 ●CXCL8の選択性 単量体・二量体CXCL8の双方を認識するCXCR2と構造を比較した結果、CXCR1では第二細胞外ループ（ECL2）が最大4 Å外側に動いていることが明らかとなりました。このループは二量体CXCL8と立体障害を起こすことが明らかとなりました（図4a）。さらにCXCR1のECL2をCXCR2のECL2と置き換えたキメラ型CXCR1CXCR2-ECL2を作製し、活性測定を行いました。その結果、このキメラ型受容体は二量体CXCL8でも活性化され、CXCR1においてECL2がCXCL8認識に重要な役割を果たしていることが明らかとなりました（図4b）。これらの結果はこれまでのCXCR1が単量体優位に結合する実験を構造学的に支持する結果となりました。   図4. (a) CXCR1のECL2における立体障害 (b) CXCR1CXCR2-ECL2を用いた活性測定結果。ECL2の置き換えによりTrapped dimerを用いても活性化されるようになったことがわかる。 今後の展開 CXCL8はガンの転移とも密接に関わっており、本研究により明らかとなったCXCR1とCXCL8の複合体の立体構造情報は、今後、がん疾患の新規薬剤の開発や既存薬剤の改良が期待されると共に、これまで困難とされてきたケモカイン受容体特異的な薬剤の開発、Gタンパク質を介したシグナル伝達の機構、免疫応答の機構解明などの知見に重要な役割を果たすことが期待されます。 研究費 本研究は、文部科学省・新学術領域研究「高速分子動画法によるタンパク質非平衡状態構造解析と分子制御への応用」の計画研究（朴三用）、JSPS科研費（基盤B JP21H024449）（朴三用）、日本医療研究開発機構（AMED）「肝炎等克服実用化研究事業」（朴三用）等の支援、また、JST 科学技術イノベーション創出に向けた大学フェローシップ創設事業 JPMJFS2140（石本直偉士）の支援を受け遂行しました。 論文情報 タイトル：Structural basis of CXC chemokine receptor 1 ligand binding and activation 著者：Naito Ishimoto*, Jae-Hyun Park*, Kouki Kawakami, Michiko Tajiri, Kenji Mizutani, Satoko Akashi, Jeremy R.H. Tame, Asuka Inoue, Sam-Yong Park （*These authors contributed equally to this work） 掲載雑誌：Nature Communications DOI：doi.org/10.1038/s41467-023-39799-2   用語説明 ＊1 ケモカイン：サイトカインの一種であり、ケモカイン受容体と結合し、白血球の遊走を誘導するタンパク質。その配列と構造の違いによってCXC、CC、CX3C、XCケモカインと呼ばれる4種類に分けられる。50種類以上のケモカインが存在し、その受容体として23種類が同定されている。 ＊2 クライオ電子顕微鏡単粒子解析：タンパク質の立体構造を明らかにする手法の一つ。生体分子をマイナス180度近い極低温状態の氷の中に包埋し、その状態で電子顕微鏡により観測する。観測した生体分子の粒子像を大量に撮影し、得られた数十万の粒子像から3次元に再構成することで立体構造を明らかにする手法のこと。 ＊３ 遊走：細胞が生体内を移動すること。こうした機構は創傷の治癒やがんの転移などにも関わっている。 ＊４ 好中球：白血球の一種。血中の循環白血球では最大60%を占めており、体内に病原体、異物の侵入を確認した場合、その組織へ移動し貪食により異物の排除を行う。 ＊5 貪食作用：食作用（ファゴサイトーシス）とも呼ばれ、自然免疫において重要な機能の一つである。この機能により生体内に外界から侵入した異物は食細胞により取り込まれ除去される。ウイルスなどに感染した初期に起こる機構の一つであり、免疫応答に重要な役割を果たしている。 ＊6 サイトカイン：免疫細胞をはじめとする細胞から分泌される低分子量のタンパク質の総称。標的細胞に対して結合することで免疫細胞の活性化や機能抑制などの細胞間の情報伝達を担っており、生体内の免疫機構の調整に重要な役割を果たしている。 ＊7 Gタンパク質共役受容体（G protein-coupled Receptor : GPCR）：ヒトゲノム中に約800種類ほど存在している7回膜貫通型の膜タンパク質。リガンドを外界からの刺激として、細胞内ではGタンパク質を介して情報を伝達する役割を担う。医薬品の約3割がGPCRを標的としており、創薬ターゲットとして注目を集めている。 ＊8 サイズ排除クロマトグラフィー：タンパク質の精製手法の一つ。溶液中の分子サイズに応じでサンプルの分離ができる。分離に用いられる担体には無数の小さな孔が空いており、サイズに応じてカラム内の移動速度が異なり、大きなタンパク質は早く、小さなタンパク質は遅い。そのため、サイズの大きいタンパク質から順に溶出する。 ＊9 エレクトロスプレーイオン化質量分析：質量分析における測定手法の一つ。大気圧下で測定溶液をイオン化し噴霧することでその質量を測定する。分子量10万程度以下のサンプルに対して測定可能であり、タンパク質などの複雑な混合物でも溶液内での状態を反映した高感度な質量分析が可能である。 ＊10 NanoBiT Gタンパク質乖離アッセイ：Large BiT（LgBiT, 約18kDa）とSmall BiT（SmBiT, 11残基）と呼ばれる2つのルシフェラーゼの分割断片で構成されており、両者は結合することで発光する。この仕組みを利用して、三量体Gタンパク質のGαサブユニットにLgBiT、GγサブユニットにSmBiTを融合した改変体を評価対象のGPCRと共に培養細胞に発現させる。Gタンパク質の活性化によって両者が乖離するため、減光を検出することで、リガンドに応じた活性を測定することができる手法。 図. NanoBiT Gタンパク質乖離アッセイの原理 記者発表資料 生命医科学研究科 問い合わせ先 横浜市立大学 広報課 mail: [email protected]  Tweet HOME ニュース一覧 ケモカイン受容体CXCR1の立体構造を世界で初めて解明 facebook twitter instagram youtube SNS一覧 YCUについて 大学紹介 法人情報 大学の取り組み 大学への寄付 学術院 100周年記念事業 大学の情報公開 研究・産学連携 研究・産学連携推進センター 研究ポリシー 知的財産・特許 学内の研究者の方へ（学内向け） 研究者データベース サイトマップ 学部・大学院 YCUの教養教育 国際教養学部 国際商学部 理学部 データサイエンス学部 医学部医学科 医学部看護学科 都市社会文化研究科 国際マネジメント研究科 生命ナノシステム科学研究科 生命医科学研究科 データサイエンス研究科 医学研究科医科学専攻 医学研究科看護学専攻 学生生活 奨学金・減免 部活・サークル ヨコ知リ ボランティア支援室 国際交流・留学 地域貢献センター 受験生の方へ 入試情報 イベント・説明会 大学院受験 大学院入試情報 キャリア・就職 キャリア支援センター 採用情報 お問い合わせ マスメディアの方へ 一般の方へ バナー広告募集 関連サイト 関連施設 附属病院 附属市民総合医療センター 学術情報センター（図書館） 先端医科学研究センター 木原生物学研究所 このサイトについて プライバシーポリシー Copyright© Yokohama City University. All rights reserved. PAGETOP close